Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
|
|
Крупный научный проектФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
|
| Показатель | 2020 | 2021 | 2022 | 2023 |
|---|---|---|---|---|
| Доля аспирантов и молодых ученых (до 39 лет) в общей численности участников проекта, не менее, % | 60 | 60 | 60 | 60 |
| Количество представленных к защите по результатам исследования диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук и на соискание ученой степени доктора наук, не менее | 0 | 0 | 7 | 1 |
| Количество статей по тематике проекта в научных изданиях первого и второго квартилей, индексируемых в международных базах данных, авторами которых являются члены коллектива участников проекта, не менее | 0 | 5 | 35 | 5 |
В рамках работ первого этапа (2020 г.) основное внимание было сосредоточено преимущественно на решении первой задачи, и были начаты исследования, направленные на решение второй задачи. При этом были получены следующие результаты:
1) Разработана и охарактеризована нейротоксическая модель БП in vitro на основе использования 1-метил-4-фенилпиридина (МФП+) – токсина дофаминергических нейронов, и клеточной культуры иммортализированных клеток LUHMES – предшественников дофаминергических нейронов человека (ИБР РАН);
2) Разработан оригинальный метод сортинга дофаминергических нейронов из гетерогенной популяции клеток черной субстанции ex vivo (также применим для смешанных культур клеток), позволяющий анализировать биохимические и молекулярно-биологические процессы, происходящие избирательно в дофаминергических нейронах (ИБР РАН);
3) Усовершенствована ранее созданная исполнителями проекта острая нейротоксическая in vivo модель доклинической стадии БП на мышах с использованием пронейротоксина 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП) и охарактеризована нигростриатная дофаминергическая система мозга по ключевым морфофункциональным показателям (ИБР РАН);
4) Созданы новые линии мышей с нейроспецифическим регулируемым нокаутом гена альфа-синуклеина, моделирующие потерю нормальной функции этого белка, что характерно для БП, и проведен анализ локомоторных функций таких мышей, а также созданы вспомогательные линии, необходимые для получения экспериментальных животных (ИФАВ РАН);
5) Получены линии мышей с конститутивным нокаутом бета- и гамма-синуклеинов (каждый по отдельности и оба вместе) (ИФАВ РАН);
6) Разработаны методы генотипирования новых животных методом ПЦР, и создан план формирования экспериментальных групп животных для проведения исследований МФТП-индуцированного паркинсонизма у взрослых мышей после прижизненной генетической инактивации альфа-синуклеина (ИФАВ РАН);
7) Разработаны методы выделения фосфорилированных изоформ бета-амилоида из крови и ликвора (ИМБ РАН);
8) Разработаны методы исследования фосфорилированных изоформ бета-амилоида с помощью масс-спектрометрии сверхвысокого разрешения и тандемной масс-спектрометрии (ИМБ РАН);
9) Оценено влияние изоформ бета-амилоида на состояние клеток гематоэнцефалического барьера (ИМБ РАН);
10) Изучены закономерности синтеза шаперонов в нейрогенных клетках при болезни Альцгеймера (БА), в частности показано, что предрасположенность к БА у старых мышей связана с подавлением системы протеостаза, и найдены индукторы молекулярных шаперонов, имеющие терапевтический потенциал для лечения БА (ИНЦ РАН);
11) Изучены механизмы гиперактивности потенциал-зависимых кальциевых каналов в нейрогенных клетках при БА с помощью модели БА – трансгенных мышей линии 5xFAD (ИНЦ РАН);
12) Проведен высокопроизводительный скрининг ингибиторов протеасомы с применением ДНК-баркодированных библиотек репрезентативностью 4,4 миллиарда индивидуальных соединений, полученных блочным синтезом, для создания потенциальных лекарственных средств терапии рассеянного склероза (ИБХ РАН); 11
13) Проведен поиск клеточных партнеров основного белка миелина с применением двухгибридной системы и библиотеки, обогащенной нейральными антигенами; было выявлено два таких партнера – убиквитин-лигаза Е1 и АТР-зависимая регуляторная субчастица протеасомы p97, и проанализировано их взаимодействие с протеасомой (ИБХ РАН);
14) Проведен анализ взаимодействия оснoвных беков с протеасомой (ИБХ РАН);
15) С помощью химической инженерии низкомолекулярных веществ разработаны модуляторы активности p53 и mdm2 – ингибиторы убиквитин-лигазы mdm2, для создания потенциальных лекарственных средств терапии рассеянного склероза (ИБХ РАН);
16) Проведен анализ структуры 26S и 20S протеасомальных комплексов с применением просвечивающей электронной микроскопии и выявлена необходимость применения криоэлектронной микроскопии сверхвысокого разрешения для определения изменений, вызванных действием природных полиаминов (ИБХ РАН);
17) Созданы генетические конструкции, обеспечивающие моделирование ON-OFF взаимодействий рецептивного поля ганглиозной клетки сетчатки, на основе катионного канального родопсина-2 и анионного канального родопсина (ИБХФ РАН);
18) Осуществлены дизайн, сборка, амплификация и клонирование в экспрессионный вектор гена родопсина колбочек человека (MW-опсина), обладающего качественно новыми свойствами – высокой светочувствительностью, быстрой кинетикой, способностью адаптироваться к изменениям интенсивности светового потока (ИБХФ РАН).
Таким образом, в течение первого этапа выполнения проекта в 2020 году были разработаны оригинальные подходы и методы для получения новых фундаментальных знаний о молекулярных механизмах патогенеза нейродегенеративных заболеваний, на основе которых могут быть разработаны новые технологии диагностики и лечения этих социально значимых заболеваний. Кроме того, были начаты фундаментальные исследования молекулярных механизмов патогенеза нейродегенеративных заболеваний и созданы первые предпосылки для разработки новых подходов к их лечению. Таким образом, все задачи, поставленные в рамках Соглашения о предоставлении из федерального бюджета грантов в форме субсидий в соответствии с пунктом 4 статьи 78.1 Бюджетного кодекса Российской Федерации № 075-15-2020-795 от 29.09.2020 на 2020 год выполнены полностью.
В рамках работ второго этапа проекта (2021 г.) были получены следующие результаты:
1) Разработана и охарактеризована нейротоксическая субхроническая модель болезни Паркинсона in vivo, воспроизводящая прогрессирующий характер нейродегенерации (ИБР РАН);
2) Изучены клеточные и молекулярные механизмы нейродегенерации и нейропластичности в нигростриатной системе мозга на субхронической модели болезни Паркинсона in vivo и на разработанных раннее моделях in vivo и in vitro (ИБР РАН);
3) Изучены механизмы нейродегенерации и нейропластичности за пределами нигростриатной системы: в других отделах мозга и периферических органах, на хронической модели болезни Паркинсона in vivo (ИБР РАН);
4) Проведена оценка уровня дофамина и его метаболитов в синапсах дофаминергических нейронов новых линиях животных с прижизненной инактивацией альфа-синуклеина без и на фоне конститутивного нокаута бета- и/или гамма-синуклеинов после введения МФТП (ИФАВ РАН);
5) Определена чувствительность дофаминергических нейронов нигростриатной системы новых линий животных с прижизненной инактивацией альфа-синуклеина без и на фоне конститутивного нокаута бета- и/или гамма-синуклеинов к действию МФТП (ИФАВ РАН);
6) Разработан быстрый и производительный метод анализа степени фосфорилирования бета-амилоида, основанный на применении MALDI-TOF-массспектрометрии (ИМБ РАН);
7) Проведено качественное сравнение особенностей фосфорилирования и распределения фосфорилированных изоформ бета-амилоида в крови и цереброспинальной жидкости человека (ИМБ РАН);
8) Установлено влияние ингибиторов киназ и фосфатаз, окислительного стресса и гипоксии на фосфорилирование бета-амилоида в модельных клеточных культурах (ИМБ РАН);
9) Изучено влияния изоформ бета-амилоида и ингибитора переносчика амилоида RAGE на проницаемость гематоэнцефалического барьера (ИМБ РАН);
10) Выявлено два перспективных соединения, способные к индукции синтеза молекулярных шаперонов, в том числе Hsp70, и демонстрирующие терапевтический эффект в модели БА (ИНЦ РАН);
11) Установлены различия в состоянии систем протеостаза (шапероны и механизм аутофагии) между молодыми и стареющими клетками и животными тканями (ИНЦ РАН);
12) Определена ключевая роль субъединицы потенциал-управляемых кальциевых каналов L-типа CaV1.2 для входа кальция в ответ на деполяризацию в нейрональной модели болезни Альцгеймера с экспрессией PS1 ΔE9 (ИНЦ РАН);
13) Изучено влияние STIM2 на вход кальция в ответ на деполяризации в нейронах гиппокампа контрольных и 5xFAD мышей (ИНЦ РАН);
14) Проведен отбор и химическая инженерия ингибиторов протеасомы (ИБХ РАН);
15) Осуществлена оптимизация модуляторов активности р53 и mdm2 (ИБХ РАН);
16) Проведена селекция искусственных оснoвных убиквитин-независимых дегронов (ИБХ РАН);
17) Определено субклеточное распределение белковых продуктов полученных конструктов, а также их работоспособность по электрофизиологической или функциональной активности разных модельных объектов (клетки линий HEK293 и РС12, нейроны гиппокампа, сетчатка мышей), экспрессирующих разработанные генетические конструкции (ИБХФ РАН);
18) Получены генетические конструкции, содержащие гены микробных родопсинов, а также колбочковых опсинов позвоночных: палочкового родопсина Rhod, мышиного SW-опсина колбочек, канального родопсина PsChR из микроводоросли Platymonas subcordiformis, а также генетические конструкции ChR2 с использованием С-концевых таргетирующих последовательностей Syn-таг и ETQV для обеспечения периферической локализации канального родопсина (ИБХФ РАН);
19) Показана цитотоксичность продуктов фотоокисления бисретиноидов липофусциновых гранул, образующихся в пигментном эпителии сетчатки человека (ИБХФ РАН).
Таким образом, в течение второго этапа выполнения проекта в 2021 году были разработаны оригинальные модели, подходы и методы для получения новых фундаментальных знаний о молекулярных механизмах патогенеза нейродегенеративных заболеваний, на основе которых могут быть разработаны новые технологии диагностики и лечения этих социально значимых заболеваний. Кроме того, были продолжены фундаментальные исследования молекулярных механизмов патогенеза нейродегенеративных заболеваний и отобраны перспективные соединения, обладающие нейропротекторными свойствами. Таким образом, все задачи на 2021 год выполнены полностью.
В рамках работ третьего этапа проекта (2022 г.) были получены следующие результаты:
1) У пациентов в группе риска развития болезни Паркинсона на продромальной (доклинической) стадии были обнаружены изменения в плазме крови концентрации L-ДОФА и уратов, индекса оксидативного стресса и экспрессии микроРНК (miR-29a, miR-19a, miR-19b), а в лимфоцитах - экспрессии генов рецептора Д3 к дофамину и белков LAG3 и PARK7, которые в совокупности представляют собой диагностическую панель биомаркеров для ранней диагностики болезни Паркинсона (ИБР РАН);
2) Созданная нами диагностическая панель биомаркеров для ранней (доклинической) диагностики болезни Паркинсона (см. результат 1) была валидирована благодаря демонстрации с помощью позитронно-эмиссионной томографии межполушарной асимметрии функциональной активности нигростриатной дофаминергической системы у пациентов в группе риска развития этого заболевания на продромальной стадии (ИБР РАН);
3) У мышей на острых нейротоксических моделях доклинической и клинической стадий болезни Паркинсона были впервые выявлены молекулярные механизмы патогенеза этого заболевания в виде изменения экспрессии генов ряда ферментов метаболизма сфингомиелинов (ASAH1, GBA1, ASAH2, CERS1, СERS5) и метаболизма самих сфингомиелинов (СМ16:0, СМ18:0, СМ20:0, С1Ф), широко вовлеченных в системные процессы нейродегенерации и нейропластичности (ИБР РАН);
4) Показана способность предсформированных фибриллярных форм α-синуклеина запускать процесс патологической агрегации в интактной нервной системе мышей (ИФАВ РАН);
5) Определено, что для распространения агрегированных форм α-синкулеина в нервной системе мышей недостаточно только инициация этого процесса с помощью предсформированных фибриллярных форм данного белка (ИФАВ РАН);
6) Создан вирусный вектор, экспрессирующий Cre-рекомбиназу под контролем нейрон-специфичного промотора (LV-NSE-Cre), для инактивации гена α-синуклеина в нервной системе взрослых трансгенных мышей (ИФАВ РАН);
7) Показано, что в модельной линии bEnd.3 происходит дефосфорилирование бета-амилоидного пептида как поверхностными, так и внутриклеточными фосфатазами (ИМБ РАН);
8) Продемонстрировано, что ключевыми ферментами, обеспечивающими дефосфорилирование бета-амилоидного пептида в клетках bEnd.3 являются белковые фосфатазы PP1 и PP2A (ИМБ РАН);
9) Установлено, что удельная интенсивность дефосфорилирования бета-амилоидного пептида в культуре клеток эндотелия мозга bEnd.3 в три раза выше, чем в культуре клеток HEK293 (ИМБ РАН);
10) Проанализировано влияние немодифицированной, фосфорилированной и изомеризованной изоформ бета-амилоида в присутствии и в отсутствие производных глутатиона нитрозоглутатиона (GSNO) и этил-глутатиона (etGSH) на проницаемость in vitro модели ГЭБ, а также на уровень белка плотных контактов – клаудина, а также на распределение клаудина и окклюдина в эндотелиальных клетках bEnd.3 (ИМБ РАН);
11) Валидирован разработанный нами ранее экспрессный и производительный метод анализа степени фосфорилирования бета-амилоида, основанный на применении MALDI-TOF-масс-спектрометрии в сочетании с иммунопреципитацией, который обладает достаточной чувствительностью (~10 пг) и точностью ±2,5% анализа фосфорилирования бета-амилоида в биологических образцах (СМЖ, ткани мозга, плазма крови) (ИМБ РАН);
12) Показано, что доля форм форсфорилированного pS8-β-амилойда в образцах тканей мозга, спинномозговой жидкости и плазме крови может составлять порядка 1–10% от немодифицированных полноразмерных форм амилоидного пептида, что хорошо согласуется с данными предыдущего этапа работы, а также данными других исследователей. Полученные результаты указывают на корреляцию фосфорилирования бета-амилоида (pS8-Aβ) с клиническими проявлениями симптомов БА (ИМБ РАН);
13) Установлено, что применение соединений КД-17.1 и КД-17.2 предотвращает развитие нарушений памяти в химически-индуцированной модели болезни Альцгеймера, кроме того, в качестве дополнительного эффекта было показано снижение беспокойства у крыс на фоне прогрессии заболевания (ИНЦ РАН);
14) Предложен механизм индукции синтеза шаперонов, опосредованный через казеин киназу 2α, для соединений КД-17.1 и КД-17.2. Изученные производные пирролилазинов оказались способны связывать киназу и значительно ограничивать ее фосфорилирующую активность (ИНЦ РАН);
15) Показано, что внеклеточное приложение инсулина к нейронам гиппокампа снижает вход кальция в ответ на деполяризацию мембраны. Ингибитор рецептора инсулина и инсулиноподобного фактора роста BMS-754807 частично отменяет эффект инсулина на потенциал-управляемый вход кальция (ИНЦ РАН);
16) Обнаружено, что в отличие от транскрипционного фактора NFAT, кальций-зависимая активация которого усилена на моделях болезни Альцгеймера in vitro, транскрипционный фактор CREB подвергается фосфорилированию в нейронах гиппокампа 5xFAD мышей и мышей дикого типа в одинаковой степени (ИНЦ РАН);
17) Показано, что обработка нейронов гиппокампа лефлуномидом снижает депо-управляемый вход кальция и вызванное им фосфорилирование CREB (ИНЦ РАН);
18) Выделены и всесторонне охарактеризованы высокогомогенные, конститутивные и иммунные препараты 20S и 26S протеасом человека. С помощью метода криоэлектронной микроскопии впервые были разрешены структуры иммунных 20S и 26S протеасом (ИБХ РАН);
19) Проведены доклинические исследования двух отобранных препаратов – ингибиторы протеасомы (ИБХ РАН);
20) Показано отсутствие токсичности наиболее активного ингибитора проесом, отобранного на животной модели рассеянного склероза, в результате исследования общей и специфическй токсичности (ИБХ РАН);
21) Получены аденоассоциированные вирусы, содержащие гены флуоресцентно-меченых родопсинов: палочкового родопсина RHO, мышиного коротковолнового SW-опсина колбочек, канальных родопсинов ChR2 из водоросли Chlamydomonas reinhardtii и PsChR из микроводоросли Platymonas subcordiformis (ИБХФ РАН);
22) Изучена экспрессия и физиологическая активность указанных микробных и животных опсинов на культурах нейронов гиппокампа и в нейронах сетчатки мышей, в том числе, в сетчатке слепых мышей с дегенерацией фоторецепторного слоя клеток (ИБХФ РАН);
23) Проведены исследования по механизму протонного транспорта светочувствительного белка ESR и получению флуоресцентно-меченого блокатора Kv1.3 канала - GFP-AgTx2 (ИБХФ РАН);
24) Отработаны подходы вирусной трансдукции сетчатки глаза мышей и последующего проведения поведенческого тестирования в темно-светлой камере и в трапециевидном водном лабиринте Морриса, отработаны методики расчета и подходы к интерпретации результатов (ИБХФ РАН);
25) Показано, что при интравитреальной инъекции вирусов, содержащих ген колбочкового SW-опсина, происходит частичное восстановление зрительной функции слепых нокаутных мышей (ИБХФ РАН);
26) С помощью морфологического анализа было показано, что в сетчатке мышей после вирусной трансдукции наблюдалась выраженная экспрессия SW-опсина в ганглиозных, биполярных и горизонтальных клетках сетчатки, причем в двух последних группах клеток наблюдалась мембранная локализация опсина (ИБХФ РАН).
Таким образом, на третьем этапе выполнения проекта (2022 г.) были разработаны оригинальные модели нейродегенеративных заболеваний и созданы новые подходы к получению фундаментальных знаний о молекулярных механизмах патогенеза этих заболеваний, на основе которых в ближайшей перспективе могут быть разработаны новые технологии ранней и дифференциальной диагностики, усовершенствована существующая симптоматическая терапия и создана новая превентивная нейропротекторная терапия нейродегенеративных заболеваний.
Все задачи, поставленные на 2022 год, выполнены полностью.
В рамках реализации четвертого (дополнительного) этапа проекта были получены следующие результаты:
1) анализ функционального состояния нигростриатной дофамин-продуцирующей системы показал, что у подавляющего большинства пациентов с риском развития БП, отобранных на предыдущих этапах проекта, наблюдается выраженная асимметрия накопления 18F-ДОФА в стриатуме (хвостатое ядро и скорлупа). (ИБР РАН);
2) из 17-ти пациентов с риском развития продромальной БП у 3-ех в течение года после ПЭТ-исследования появились двигательные симптомы, что является наиболее убедительным доказательством эфективности использованной технологии для диагностики БП на продромальной стадии и открывает широкие перспективы для поиска биомаркеров в крови этой стадии заболевания;
3) проведена оценка стабильности 11 генов домашнего хозяйства в черной субстанции мышей при моделировании клинической стадии БП и было показано, что Rps27a имеет наиболее стабильную экспрессию как в нормальных условиях, так и при моделировании БП. Помимо этого гена было идентифицировано еще 5 генов, экспрессия которых достаточно стабильна при нейродегенерации: Ube2d2a, Hprt, Cyc1, Sdha, Rpl13;
4) показано поэтапное снижение содержания функционально значимых для метаболизма дофамина белков: тирозингидрокислазы (ТГ) и транспортера дофамина (ДАТ), в стриатуме и черной субстанции по мере прогрессирования деградации нигростриатной доофаминергической системы, при этом более выраженное снижение уровня ДАТ по сравнению с ТГ может свидетельствовать о нарушении аксонального транспорта;
5) при количественной оценке деафферентации стриатума дофаминергическими нейронами при переходе от доклинической к клинической стадии БП на животных моделях, выявлено, что скорость деградации дофаминергических волокон в стриатуме не линейна и на ранних сроках дегенерации она выше;
6) обнаружено, что при моделировании БП дофаминергические волокна адаптируются к токсическому действию МФТП за счет снижения ДАТ, что приводит к меньшему захвату МФП+, собственно токсину дофаминергических нейронов, метаболиту МФТП;
7) получена новая линия трансгенных мышей NEAT1_1Tg, моделирующих функциональную избыточность длинной некодирующей РНК Neat1 и было показано, что трансген NEAT1_1 в нервной системе экспрессируется на высоком уровне в мозжечке, в меньшей степени в спинном мозге и коре головного мозга, при этом экспрессия короткой изоформы NEAT1_1 человека в нервной системе трансгенных мышей не оказывает влияние на уровень экспрессии собственной Neat1 мыши;
8) трансгенные животные NEAT1_1Tg не отличаются от контрольных мышей дикого типа по показателям двигательной активности, депрессивно-подобного поведения, моторной функции, кратковременной памяти, в то же время у трансгенных мышей значительно снижен уровень тревожности и нарушена долговременная память, также в головном мозге трансгенных мышей не наблюдается изменений общей морфологии и числа нервных клеток, распределения и количества маркеров нейровоспаления;
9) оценка выживаемости и апоптотической гибели клеток первичных культур, полученных от трансгенных NEAT1_1Tg и контрольных мышей после воздействия на них разных типов стресса, показала, что трансген по-разному влияет на выживаемость и апоптотическую гибель клеток в культуре при разном типе стресса;
10) для изучения возможности влияния повышенного уровня NEAT1_1 на развитие патологического процесса, вызванного агрегацией белка FUS, который взаимодействует с NEAT1, была получена гибридная линия мышей NEAT1_1TgxhFUS1-359. Наличие трансгена hFUS1-359 определяло развитие у животных модельного заболевания, характеризующегося гибелью двигательных нейронов;
11) сделан вывод о возможности использования NEAT1_1 в качестве молекулярной мишени для влияния на устойчивость нервных клеток к различным типам стресса;
12) проведено сравнение эффективности транспорта изоформ бета-амилоида (Aβ) через эндотелий в модели ГЭБ и установлено, что посттрансляционные модификации являются факторами, модулирующими транспорт изоформ Aβ из тканей мозга;
13) выявлено, что изоформы бета-амилоида обладают различными механизмами транспорта через эндотелий ГЭБ: транспорт всех изоформ в направлении из крови в мозг происходит с помощью кавеолин-зависимого эндоцитоза и в основном обусловлен связыванием с RAGE, однако прохождение iso-Aβ42 в данном направлении также может происходить посредством клатрин-зависимого эндоцитоза;
14) показано, что транспорт изоформ бета-амилоида в направлении из тканей мозга в кровь является клатрин-зависимым, однако ингибитор клатрин-зависимого эндоцитоза – хлорпромазин – значительно сильнее снижает прохождение Aβ42, чем pS8-Aβ42 и iso-Aβ42;
15) установлено, что патогенная олигомеризация изоформ бета-амилоида значительно снижает клиренс Aβ42 и iso-Aβ42 из тканей мозга;
16) выявлено, что применение блокаторов (соединение FPS-ZM1) и активаторов (альбумин) переноса белков способно улучшить клиренс патогенных форм бета-амилоида из тканей мозга;
17) показано, что интактный Аβ42 обладает большей способностью накапливаться внутри клеток, тогда как уровень накопления iso-Аβ42 минимальный по сравнению с другими пептидами. Выявлено, что как для Aβ42, так и для iso-Aβ42, не наблюдается деградации пептидов внутри клеток;
18) показано, что при оксидативном стрессе нейронов человека, полученных с помощью репрограммирования из мезенхемальных стволовых клеток, происходит старение нейронов, сопровождаемое повышением уровня β-галаксидазы и экспрессией таких маркеров старения, как p16 и p21;
19) применение производной пирролизина PQ-29 привела к повышению уровня экспрессии молекулярных шаперонов, Hsp70, Hsp90 и Hsp40, предотвратило развитие признаков старения и снизило клеточную гибель;
20) показано, что у животных, моделирующих болезнь Альцгеймера, по сравнению в их здоровыми сиблингами, падение системы клеточного протеостаза происходит значительно быстрее, что делает возможным формирование амилоидных агрегатов, а применение веществ из семейства пирролизинов, продлевало время активности системы клеточного протеостаза, и задерживало формирование амилоидных агрегатов;
21) показано отсутствие статистически значимых различий в амплитудах депо- управляемых и потенциал-управляемых токов для клеток здорового донора (ЗД) которые были репрограммированы в ГАМК-эргические срединные шипиковые нейроны стриатума с помощью различных подходов: с использованием лентивируса (интеграционный подход) либо вируса Сендай (неинтеграционный подход);
22) эксперименты проведенные на линиях клеток, специфичных для пациента с болезнью Гентингтона (БГ), полученных с помощью различных подходов репрограммирования, показали отсутствие достоверных отличий в амплитудах депо-управляемого входа кальция на стационарном уровне развития токов при потенциале –80 мВ и в амплитудах потенциал- управляемого входа кальция при потенциале –20 мВ Данные флуоресцентного кальциевого имиджинга также не выявили отличий в амплитудах депо-управляемого и в уровнях тапсигаргин- индуцированного кальциевого выброса в клетках БГ лентивирус и БГ Сендай;
23) уровни экспрессии белков активаторов депо-управляемых кальциевых каналов STIM1 и STIM2 не имеют статистически значимых различий для пар клеточных линий ЗД Лентивирус и ЗД Сендай, а также БГ Лентивирус и БГ Сендай;
24) впервые изучено взаимодействие основного белка миелина (МВР) на встраиваемый в мебрану белок В II типа (ITM2В) и показано нарушение фуринового протеолиза и последующего мембранного транспорта ITM2B в результате взаимодействия с МВР;
25) создана вирусная конструкция pAAV-CAG-SWopsin-FLAG-TS-1D4-IRES-mCherry, кодирующая коротковолновой колбочковый опсин млекопитающих (SWopsin);
26) исследования свойств конструкции pAAV-CAG-SWopsin-FLAG-TS-1D4-IRES-mCherry на культивируемых нейронах и способности этой конструкции к восстановлению зрительных функций слепых мышей линии RD1 свидетельствуют о перспективности коротковолнового колбочкового опсина млекопитающих (SWopsin) как оптогенетического «инструмента» для частичного восстановления зрительные функций слепых нокаутных мышей;
27) создана химерная светочувствительная вирусная конструкция AAV7m8-CAG- OptoGq-EGFP, состоящая из наружной и трансмембранных частей опсина и цитоплазматических петель и внутриклеточного участка - С-концевой части адренорецептора, т.н. OptoGq конструкция;
28) OptoGq конструкция впервые применена для протезирования дегенеративной сетчатки: в поведенческих опытах на нокаутных мышах она оказалась способной восстановить зрительные функции слепых мышей линии RD1 (пигментный ретинит);
29) открыт молекулярный механизм исчезновения меланина в клетках РПЭ: при действии видимого света, главным образом фиолетово-синего спектрального диапазона, в липофусциновой части меланолипофусциновой гранулы образуются активные формы кислорода, которые разрушают меланиновую часть гранулы, в результате чего концентрация меланина в клетках РПЭ падает.
Таким образом, на четвертом (дополнительном) этапе выполнения проекта были разработаны оригинальные модели нейродегенеративных заболеваний и созданы новые подходы к получению фундаментальных знаний о молекулярных механизмах патогенеза этих заболеваний, на основе которых в ближайшей перспективе могут быть разработаны новые технологии ранней и дифференциальной диагностики, усовершенствована существующая симптоматическая терапия и создана новая превентивная нейропротекторная терапия нейродегенеративных заболеваний.
Все задачи на 2023 год выполнены полностью.
